EINGABE
• Ziel
• Erkennung bakterieller Spezies, Angabe einer Wahrscheinlichkeit zum Multiresistenzpotential
• Beurteilung der Machbarkeit mit gegebener Instrumentierung
• Voraussetzung im Kleinen
• Hinreichende Stabilität bakterieller Raman-Spektren: Abweichungen bei Messungen von gleicher Spezies / gleichem Stamm an/in/auf unterschiedlichen Tagen / Ansätzen des Mediums / Kammern eines Slides / Slides / Zeit nach Kulturbeginn / Kulturen / … müssen klein sein gegenüber Abweichungen zwischen unterschiedlichen Spezies/Stämmen
• Voraussetzung im Großen
• Beibehalten des Stabilitätskriteriums: kompensierbare Abweichungen der Spektren bei Messung an unterschiedlichen Geräten / Nutzbarkeit bzw. Übertragbarkeit einer einmalig erstellten Spektrendatenbank, Durchführung der Laborarbeit und Gerätebedienung durch unterschiedliches Personal, Einbeziehen präparatorischer Schritte, d.h. Isolieren von Zellen aus klinischen Proben,
• Details zur Chemometrie
• Was genutzt?
• Vorbearbeitung (rechentechnische Schritte zur Kompensation systematischer unkorrelierter Varianzen): Bereinigung „kosmischer Strahlen“ / schmalbandiger Signale, gemeinsame x-Achse /Interpolieren, Glättung (Savitzky-Golay), BL-Korrektur unter Einbinden eines Kontaminationsspektrums (Beier et al.) + Rolling-Ball-Korrektur
• SIMCA: Modellierung spektraler Klassen zum Repräsentieren bakterieller Stämme inklusive Aussage zur Klassenzugehörigkeit unbekannter Spektren („one-class“, „soft“, „local“).
• Spektrenweise und variablenweise Skalierung mit „VAST“: der Einfluss einer Bande auf das Klassifizierungsergebnis hängt nicht von ihrer (absoluten oder relativen) Intensität, jedoch sehr wohl von ihrer „Stabilität“ (MW/Stabw) ab.
• Berechnung der Hauptkomponenten „intra-Klasse“ auf Basis der Datenbankspektren. Anwendung des Skalierungsvektors auf zu testende Spektren, anschließend Projizieren der so transformierten Spektren auf die Hauptkomponenten pro Klasse,
• Berechnung statistischer Kennzahlen (T2 und Q) und in Bezug setzen zu deren Grenzwerten (basierend auf f-Statistik und Vertrauensniveau 95%)
• Was getestet?
• Sinnvolle Kombinationen der Parameter für Spektrenprozessierung zur Optimierung der SIMCA-Klassifizierung
• Mögliche Ursachen der Instabilität der Raman-Spektren (s.o.): experimenteller Ansatz (Verdunstung des Wassertropfens für Immersionsmikroskopie, Unterschiede im Fluoreszenzspektrum der Glasabdeckung bereits innerhalb eines Slides, ) und mathematischer Ansatz (Instabilität der Beier-Korrektur / Verstärkung systematischer Varianzen anstatt Abschwächung, Fehler in vorhandenen Python-Funktionen, …)
• Wie getestet
• Messreihen und Versuchsansätze entsprechend obiger Kriterien
• Aktueller Stand Resumé
• Aufbau eines umfangreichen Auswerteskripts inklusive Klassifizierung
• Die Klassifizierung von Raman-Spektren bis zur Feinheit einzelner Stämme, die sich im Resistenzpotential unterscheiden, ist nicht machbar
• Ausstehende restliche Möglichkeiten
• Ergänzung um „online“-Kalibrierung mit PS (vor jeder Messreihe), automatische Entfernung von Ausreißerspektren statt bloßer „Kosmosstrahlen“-Korrektur, Überprüfung der Python-Funktionen bzw. Ersetzen durch selbstgeschriebene Funktionen, Verwendung teurer Quarzgläser mit Kammern(?)
Das Ziel des Projekts besteht in der Erkennung bakterieller Spezies und der Angabe einer Wahrscheinlichkeit zum Multiresistenzpotential. Hierbei wird die Machbarkeit der Untersuchung unter den gegebenen Instrumentierungsbedingungen bewertet. Im Kleinen ist eine hinreichende Stabilität der bakteriellen Raman-Spektren von entscheidender Bedeutung; Abweichungen bei Messungen von derselben Spezies oder demselben Stamm, die an unterschiedlichen Tagen, in unterschiedlichen Ansätzen des Mediums oder in verschiedenen Kammern eines Slides erfolgen, müssen gering sein im Vergleich zu den Abweichungen zwischen unterschiedlichen Spezies oder Stämmen. Im Großen betrachtet bleibt das Stabilitätskriterium wichtig: Es müssen kompensierbare Abweichungen der Spektren bei Messungen an unterschiedlichen Geräten gewährleistet sein, einschließlich der Nutzbarkeit und Übertragbarkeit einer einmal erstellten Spektrendatenbank und der Durchführung der Laborarbeit durch unterschiedliches Personal. Auch präparatorische Schritte, wie das Isolieren von Zellen aus klinischen Proben, werden in diesem Zusammenhang berücksichtigt.
Zur Chemometrie werden verschiedene Vorbearbeitungsschritte genutzt, um systematische unkorrelierte Varianzen zu kompensieren, darunter die Bereinigung von „kosmischen Strahlen“ und schmalbandigen Signalen, die Verwendung einer gemeinsamen x-Achse sowie Interpolations- und Glättungstechniken wie die Savitzky-Golay-Glättung. Zusätzlich wird die Basislinienkorrektur unter Einbeziehung eines Kontaminationsspektrums (Beier et al.) und die Rolling-Ball-Korrektur angewendet. Mit SIMCA wird eine Modellierung spektraler Klassen zur Repräsentation bakterieller Stämme durchgeführt, einschließlich Aussagen zur Klassenzugehörigkeit unbekannter Spektren. Dabei erfolgt die spektrenweise und variablenweise Skalierung mit „VAST“, wobei der Einfluss einer Bande auf das Klassifizierungsergebnis von ihrer Stabilität abhängt. Die Berechnung der Hauptkomponenten „intra-Klasse“ basiert auf den Datenbankspektren, und nach Anwendung des Skalierungsvektors auf zu testende Spektren werden diese auf die Hauptkomponenten pro Klasse projiziert. Es werden statistische Kennzahlen (T2 und Q) berechnet und mit den entsprechenden Grenzwerten in Bezug gesetzt, die auf f-Statistik und einem Vertrauensniveau von 95% basieren.
Testet werden sinnvolle Kombinationen der Parameter für die Spektrenprozessierung zur Optimierung der SIMCA-Klassifizierung sowie mögliche Ursachen der Instabilität der Raman-Spektren, die sowohl experimentelle als auch mathematische Ansätze betreffen. Die Messreihen und Versuchsansätze orientieren sich an den zuvor genannten Kriterien. Aktuell wird ein umfangreiches Auswerteskript inklusive Klassifizierung aufgebaut, wobei die Klassifizierung von Raman-Spektren bis zur Feinheit einzelner Stämme, die sich im Resistenzpotential unterscheiden, als nicht machbar erachtet wird. Ausstehende Möglichkeiten zur Verbesserung umfassen die Ergänzung um „online“-Kalibrierung mit PS vor jeder Messreihe, die automatische Entfernung von Ausreißerspektren anstelle einer bloßen „Kosmosstrahlen“-Korrektur, die Überprüfung der Python-Funktionen oder deren Ersetzung durch selbstgeschriebene Funktionen sowie die Verwendung teurer Quarzgläser mit Kammern.